Паразитарные инфекции: вирусы

Вирусы могут вызывать заболевание, преодолевая естественные защитные барьеры организма и уклоняясь от иммунного контроля, разрушая клетки или вызывая воспалительный и иммунный ответ, который может нанести вред самому организму. Развитие вирусной инфекции определяется типом взаимоотношений вирус-хозяин и реакцией хозяина на инфекцию.

Иммунный ответ – лучший инструмент для борьбы с распространением вируса, однако иногда он может способствовать патогенезу инфекции. Ткань-мишень вируса определяет природу заболевания и его симптомы. Вирусные факторы и факторы хозяина модулируют тяжесть болезни, при этом важны: вирусный инокулят и его вирулентность (степень способности вызвать заражение), а также общее состояние хозяина. Способность контролировать инфекцию с помощью собственного иммунного ответа определяет меньшую или большую тяжесть и продолжительность вирусного заболевания.

Вирусы, общие для определенного тканевого тропизма, могут вызывать сходные болезни, такие как гепатит, респираторные заболевания или энцефалит. С другой стороны, один и тот же вирус может вызывать разные патологические состояния и даже бессимптомные инфекции. Многие вирусные инфекции могут представлять жизненно важную угрозу для пациентов с ослабленным иммунитетом, детей и пожилых людей.

Патогенные вирусы характеризуются экспрессией факторов вирулентности, которые повышают эффективность репликации вируса, передачи, проникновения и прикрепления к ткани-мишени или обладают способностью нейтрализовать защитные силы хозяина и его эффективный иммунный ответ. Потеря факторов вирулентности предполагает ослабление вируса, но не приводит к затруднению роста в клеточных культурах, поэтому она использовалась в качестве стратегии вакцинации для получения иммуногенных и авирулентных вирусных штаммов.

Основные этиопатогенные механизмы

Вирусное заболевание прогрессирует с помощью ряда определенных этапов, связанных с репликацией вируса.

Развитие вирусной инфекции

На начальном этапе инкубация заболевания может протекать бессимптомно или вызывать неспецифические симптомы, называемые продромальными, во многих случаях из-за немедленной реакции иммунной системы и местной защиты. Симптомы заболевания вызваны повреждением тканей, из-за репликации вируса, а иногда и активации собственной иммунной системы хозяина. Эти симптомы могут сохраняться в период выздоровления, пока восстанавливаются поврежденные ткани. Выработка специфического и эффективного иммунного ответа может защитить от будущих столкновений с вирусом.

Вирус проникает в организм пассивным путем через кожу (порезы, укусы, проколы) или через слизистый барьер на разных уровнях (дыхательные пути, мочеполовые пути и желудочно-кишечный тракт, конъюнктива глаза и слизистая оболочка полости рта). Существуют местные средства защиты, препятствующие проникновению вируса. Неповрежденная кожа является отличным барьером, и к ней добавляются другие защитные средства, такие как слизь и реснитчатый эпителий слизистой оболочки дыхательных путей, желудочная кислота, желчь и присутствие иммуноглобулина (Ig) А в слизистых оболочках.

В месте проникновения вируса происходит его репликация. Для этого нужны клетки, которые экспрессируют подходящие рецепторы и способствуют их репликации. Многие вирусы инициируют свою репликацию в клетках слизистой оболочки полости рта и верхних дыхательных путей. Репликация в первичном месте может быть симптоматической и приводить к распространению в другие ткани через кровь или лимфатическую систему. Также некоторые вирусы используют нейронные «удлинители» (нейронные пути) для распространения в нервной системе.

Через кровеносную и лимфатическую системы вирус может достичь любой части организма. Таким образом, вызвав повреждение тканей, способствующее появлению макрофагов, он использует их в качестве транспорта и защиты. Мукоэпителиальные клетки также могут содержать вирус и способствовать его распространению.

Транспортировка вируса через кровь называется виремией. Вирус может свободно перемещаться в плазме или внутри лимфоцитов и макрофагов. Репликация внутри макрофагов, эндотелиальных клеток или клеток ретикулоэндотелиальной системы может усиливать и инициировать развитие вторичной виремии. Иногда эта вторичная виремия предшествует проникновению вируса в ткани-мишени и началу проявления симптомов.

Вирусы также могут получать доступ к центральной нервной системе через кровь, менингеальные оболочки, миграцию инфицированных макрофагов или заражение нервных окончаний.

Вирусный патогенез

Вирусная инфекция может развиваться тремя различными путями:

1. Литическая инфекция, вызывающая разрушение клеток из-за повреждения, вызванного репликацией вируса.

2. Стойкая инфекция, при которой вирус размножается, не вызывая гибели клеток. Эти персистирующие инфекции могут быть хроническими (продуктивными, но нелитическими), латентными (с частичной репликацией без образования полноценных вирусных частиц), рецидивирующими (с периодами латентности и репликации) и трансформирующими (которые, иммортализуя инфицированную клетку, может вызвать трансформацию опухоли).

3. Абортивная инфекция из-за появления вирусных мутантов, которые не могут размножаться внутри клетки.

Природа инфекции зависит от характеристик вируса и клетки-мишени. Непермиссивная клетка из-за отсутствия подходящих рецепторов, необходимых активаторов транскрипции или экспрессии противовирусных механизмов предотвращает репликацию вируса. Напротив, пермиссивная клетка обеспечивает механизм биосинтеза, необходимый для полной репликации вируса. Эта репликация может привести к изменениям в клетке, ее внешнем виде и функциональных свойствах.

Литические инфекции. Репликация вируса может вызывать эффекты, которые приводят к гибели клетки. Стремясь создать условия, необходимые для размножения, существуют вирусы, которые подавляют синтез клеточных макромолекул или продуцируют разрушающие и токсичные ферменты. Таким образом, герпесвирусы ингибируют синтез клеточной ДНК или мРНК и синтезируют белки, которые разрушают ДНК хозяина, получая материал для своей репликации. Синтез клеточного белка может блокироваться ферментами или пассивно гиперпродукцией вирусной мРНК, конкурирующей с клеткой. Накопление компонентов и новых вирусных частиц внутри клетки нарушает ее внутреннюю структуру и функциональность, вызывая гибель клеток. Экспрессия вирусных молекул, распознаваемых как антигены, на поверхности клетки облегчает действие иммунной системы, способствующей разрушению пораженных клеток.

В некоторых случаях последствия вирусной инфекции вызывают апоптоз клетки, способствуя высвобождению вируса, даже если это приводит к разрушению механизма репликации. По этой причине некоторые вирусы (герпесвирусы, вирусы папилломы, аденовирусы) выработали механизмы ингибирования апоптоза.

Экспрессия на клеточной поверхности вирусных гликопротеинов оболочки может индуцировать сигналы слияния мембраны с соседними клетками и образование синцитов (парамиксовирусов, ретровирусов). Эта ситуация позволяет вирусу распространяться от клетки к клетке, избегая обнаружения антителами, хотя клеточные синциты хрупки и очень восприимчивы к лизису.

Некоторые вирусные инфекции вызывают клеточные изменения внешнего вида и функций клеток. Могут возникнуть хромосомные изменения и гистологические изменения. Иногда новые структуры (тела включения) образуются в цитоплазме или ядре в результате репликации вируса и полезны при диагностике определенных вирусных инфекций благодаря своим микроскопическим характеристикам. Также появляется вакуолизация и неспецифические клеточные и гистологические изменения.

Нелитические инфекции. Когда клетка не разрушается в процессе репликации вируса, мы сталкиваемся с персистирующей инфекцией, чего достигают некоторые вирусы с ограниченным производством новых частиц и высвобождением в результате экзоцитоза или почкования вирусной частицы, заключенной в фрагмент клеточной мембраны.

Репликация вируса может быть скрытой в течение определенных периодов времени у определенных вирусов (герпесвирусов) из-за того, что клетка не вносит факторы транскрипции, необходимые для инициирования репликации вирусных частиц. Эта ситуация может измениться в результате активации клетки под действием гормонов или цитокинов, стрессовых ситуаций или других раздражителей, что может вызвать репликацию вируса.

Трансформирующие инфекции. Некоторые ДНК-вирусы и ретровирусы могут вызывать стойкие инфекции, которые стимулируют рост клеток, вызывая трансформацию и иммортализацию инфицированной клетки, и вести себя как потенциально онкогенные вирусы. Механизмы иммортализации клеток включают активацию или добавление генов, стимулирующих рост, блокирование или инактивацию клеточных механизмов, ограничивающих синтез ДНК и репликацию клеток, или путем предотвращения апоптоза.

Иммортализация клеток, инфицированных некоторыми ДНК-вирусами, включает дефективную и неполную репликацию вируса. В некоторых случаях вирусный геном интегрируется в клеточную хромосому, и они экспрессируют белки, которые изменяют механизмы клеточного контроля (вирусы папилломы). В других случаях (онкогенные ретровирусы) они синтезируют онкогенные белки, подобные клеточным белкам, участвующие в активации роста клеток или стимуляции экспрессии этих белков генами-трансактиваторами.

Некоторые вирусы, даже обладая механизмами прямой трансформации, могут вызывать косвенный онкогенез (вирус гепатита В [ВГВ] или С [ВГС]) из-за повреждения, вызванного стойкой инфекцией, и действия механизмов восстановления клеток, которые могут способствовать мутациям, вызывающим трансформацию клеток. Этой ситуации в контексте иммуносупрессии, например, вызванной инфекциями, спровоцированными вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), способствует отсутствие эффективных иммунологических механизмов обнаружения и уничтожения инфицированных клеток.

Хотя индуцированная вирусом трансформация клеток является необходимым первым шагом, ее может быть недостаточно, чтобы вызвать онкогенез и образование опухоли. Однако иммортализованные клетки более чувствительны к накоплению мутаций или модификаций хромосом, а также к действию стимуляторов роста клеток.

Защита от вирусной инфекции

Целью противовирусного ответа хозяина является предотвращение проникновения и распространения вируса, способствуя его элиминации и уничтожению инфицированных им клеток. Иммунный ответ является наиболее оптимальным механизмом и в большинстве случаев позволяет контролировать вирусную инфекцию. Как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ играют важную роль в механизмах противовирусной защиты.

Хотя существуют естественные барьеры, препятствующие проникновению вируса на уровне кожи и слизистых оболочек, как только они преодолены, активируется врожденная и неспецифическая иммунная защита (интерферон, макрофаги, дендритные клетки, естественные цитотоксические клетки [NK-природный убийца -]), которые пытаются ограничить и контролировать репликацию и распространение вируса из места проникновения. Вирусные молекулы, включая их геном, распознаются мембранными и эндоцитарными рецепторами, которые активируют экспрессию генов, кодирующих синтез интерферона и других медиаторов, способствующих клеточному ответу.

Хотя специфическому антитело-ответу требуется несколько дней, чтобы он стал доступным и эффективным при первом контакте с вирусом, этого механизма может быть достаточно для устранения инфекции. Антитела эффективны против цитолитических вирусов и необходимы для контроля распространения вируса в другие органы на стадии виремии. Клеточный иммунитет необходим для уничтожения клеток, инфицированных нецитолитическими вирусами.

Первичная вирусная инфекция генерирует иммунную память в Т- и В-лимфоцитах, которые немедленно реагируют на новые инфекции, вызванные аналогичными вирусами, ограничивая распространение вируса, а сывороточные антитела нейтрализуют возможную виремию. Эффективность вторичного ответа на контакт с вирусом является основой первичной профилактики с помощью вакцин.

Некоторые вирусы разработали механизмы, позволяющие избежать иммунного контроля, включая блокирование синтеза интерферона, диффузию между клетками, внесение антигенных изменений или изменение механизмов представления антигена и функции лимфоцитов.

Иммунопатология

Большинство симптомов вирусной инфекции вызываются воспалительной реакцией, вызванной противовирусным иммунным ответом. Эффекты интерферона и цитокинов, продуцируемых при врожденном ответе, ответственны за неспецифическую картину при респираторной вирусной инфекции и иногда предшествуют (продромальный период) наиболее характерной симптоматике, как только вирус достигает своего органа-мишени.

Позже циркулирующие иммунокомплексы, индуцированный лимфоцитами ответ CD4 и цитолитическое действие лимфоцитов CD8 ответственны за повреждение тканей, которое иногда сопровождается вирусной инфекцией. Высвобождение медиаторов воспаления вызывает ситуацию, которую трудно контролировать, как это происходит при вирусных инфекциях с оболочкой. Менее активный иммунный ответ у детей, особенно в их NK-клетках, приводит к тому, что вирусные инфекции в детском возрасте развиваются с меньшими симптомами и протекают легче, хотя отсутствие эффективного иммунного ответа может привести к стойкой хронической инфекции некоторыми вирусами.

Классификация синдромов

Восприимчивость человека и тяжесть вирусного заболевания относительны и зависят от различных факторов:

• механизмов и места заражения;
• факторов хозяина, таких как возраст, иммунный статус, состояние здоровья и генетическая предрасположенность;
• вирусных факторов, таких как инокулят и вирулентность заражающего штамма.

После того, как человек был инфицирован, именно компетентность его иммунной системы является наиболее определяющим фактором в развитии вирусного заболевания. В инкубационный период вирус начинает свою репликацию, но еще не нанес достаточного повреждения тканям. Инкубационный период относительно короткий (1-2 дня), если первичным очагом инфекции является орган-мишень, и у него проявляются симптомы, характерные для заболевания. Более длительные инкубационные периоды (иногда годы) будут необходимы, когда вирусу потребуется распространиться на другие участки организма, где находятся клетки, подходящие для его репликации, и вызвать прямое повреждение тканей или иммунопатологическое повреждение.

Характер и тяжесть симптомов вирусного заболевания связаны с функцией пораженного органа (головного мозга, печени и т. д.) и важностью иммунопатологического ответа, вызванного инфекцией. Во многих случаях инфекция незаметна, потому что инфицированная ткань не повреждена, инфекция контролируется до того, как вирус достигнет органа-мишени, или возможно, что пораженная ткань органа-мишени может быть разрушена без нарушения функции, минимально повреждена или быстро восстановлена. Инфекции, протекающие незаметно, являются важным источником заражения и передачи вирусных инфекций.

Диагностические стратегии

За последние несколько лет методология диагностики вирусных инфекций была существенно изменена, так что в настоящее время существует множество вариантов получения чувствительной и точной идентификации вирусной инфекции по клиническим образцам. Лучшее качество моноклональных антител для прямого обнаружения вирусных антигенов и технологическая революция, которую произвели молекулярные методы для прямой идентификации вирусного генома, позволяют все чаще с меньшим временем отклика обнаруживать и идентифицировать вирусы, что позволяет на раннем этапе выбирать подходящие терапевтические альтернативы.

История болезни и симптомы пациента дают первые ключи к диагностике вирусной инфекции, исключая другие типы инфекции (бактериальную, грибковую). Лабораторные исследования направлены на:

• подтверждение диагноза путем выявления вирусного возбудителя инфекции;
• определение подходящего противовирусного лечения;
• определение течения вирусного заболевания;
• эпидемиологический мониторинг заболевания;
• предоставление информации медицинскому персоналу и пациентам.

Лаборатория может предоставить соответствующую информацию, описав:

• цитопатический эффект, вызываемый вирусом на инфицированные клетки;
• обнаружение вирусных частиц с помощью электронной микроскопии;
• выделение и рост вируса в клеточной среде in vitro;
• обнаружение вирусных компонентов (белков и геномы);
• оценка иммунного ответа пациента на вирус (серология).

Процедуры, основанные на микроскопии, как оптической, так и электронной, целью которых является непосредственное наблюдение вирусной частицы или обнаружение цитопатического воздействия на инфицированную клетку, имеют смысл только в очень ограниченном количестве клинических диагностических ситуаций и требуют условий оборудования, зарезервированных для лабораторий высокого уровня.

Аналогичным образом, клеточные культуры, которые с момента своего развития были эталонным методом вирусной диагностики, были превзойдены по чувствительности молекулярными методами, которые также достигли превосходной специфичности. Таким образом, предотвращается выделение вируса, что в большинстве случаев не требуется для постановки правильного диагноза, и предотвращается или снижается риск для персонала лаборатории. Тем не менее, он по-прежнему играет важную роль в изучении вирусной инфекции на клеточном уровне и характеристике вирусных вариантов и новых штаммов. По этой причине его использование ограничивается справочными центрами и исследовательскими лабораториями.

Отбор проб

Симптомы пациента и его история болезни, включая недавние поездки, возраст, время года, в которое развивается клиническая картина, и вероятный диагноз, помогают определить процедуры, которые следует использовать для идентификации вирусного агента. Например, энцефалит, локализованный в височной доле, которому предшествуют головные боли и дезориентация, свидетельствует о герпетической инфекции и требует анализа спинномозговой жидкости молекулярными методами.

Развитие менингеальных симптомов летом может быть связано с арбовирусным менингитом, и для молекулярного и серологического исследования необходимы образцы спинномозговой жидкости и крови. В случае энтеровирусной инфкуции, в дополнение к спинномозговой жидкости, было бы интересно иметь образцы носоглотки и кала для молекулярного анализа и вирусной идентификации. Поэтому выбор подходящего образца может быть сложным, поскольку разные вирусы вызывают сходные клинические картины и могут быть диагностированы в разных образцах.

Образцы должны быть собраны на ранней стадии острой фазы инфекции, до того, как вирус снизит репликативную способность. Например, респираторные вирусы предпочтительно удаляются в течение 3-7 дней от начала инфекции и исчезают до появления симптомов. Вирусы простого герпеса и опоясывающего лишая, ветряной оспы обнаруживаются только в очагах с течением менее 5 дней с момента появления симптомов, а энтеровирусы диагностируются в спинномозговой жидкости только через 2 или 3 дня. Кроме того, реакция нейтрализующих антител может затруднить обнаружение вируса. Серологическое обследование на первичную инфекцию должно проводиться в нужное время, чтобы результат был клинически значимым.

Методы прямой диагностики

Цитология. Вирусы могут вызывать характерные цитопатические эффекты в образцах тканей и в клеточных культурах, включая морфологические изменения, такие как лизис клеток, вакуолизация, синцитии и тельца включения. Цитологические образцы могут быть исследованы на наличие специфических вирусных антигенов методами прямой иммунофлуоресценции, а вирусный геном может быть идентифицирован с помощью гибридизации и/или полимеразной цепной реакции (ПЦР) in situ. Этот тип теста с использованием специфических реагентов выбирается после соответствующей дифференциальной диагностики.

Электронная микроскопия. Электронная микроскопия не является обычным методом среди лабораторных методов клинической микробиологии, но их можно использовать для обнаружения и идентификации некоторых вирусов, присутствующих в образце с достаточным количеством вирионов, особенно если используются методы иммуноэлектронной микроскопии.

Клеточные культуры. Вирус может расти на клеточных культурах, эмбриональных яйцах и подопытных животных. Хотя эмбриональные яйца по-прежнему используются для выращивания вирусов, необходимых для изготовления некоторых вакцин, их использование в обычном выделении вирусов было заменено клеточными культурами. Точно так же подопытные животные редко используются для выделения вирусов.

Вирус обнаруживается и идентифицируется в культуре клеток по формированию цитопатических эффектов, иммунофлуоресценции или молекулярному анализу генома. В тех случаях, когда рост очень медленный и непродуктивный или вирусы очень опасны для обработки и требуют очень строгих мер по изоляции, более практично и разумно использовать молекулярные и серологические методы.

Обнаружение вирусных антигенов. Антитела могут использоваться в качестве специфических и чувствительных реагентов для обнаружения, идентификации и количественной оценки вирусов или вирусных антигенов в клинических образцах или клеточных культурах (иммуногистохимия). Моноклональные антитела позволяют специфически различать близкородственные вирусы с помощью иммунофлуоресцентных, иммуноферментных методов (ИФА) и латексных частиц. Существует множество коммерческих анализов, которые предлагают быструю, чувствительную и специфическую диагностику при диагностике некоторых вирусов (респираторно-синцитиальный вирус, ротавирус), которые обычно используются в лаборатории.

Молекулярное обнаружение вирусного генома. Структура и последовательность генов являются фундаментальными характеристиками для различения вирусов. Существуют различные методы, позволяющие дифференцировать и идентифицировать вирусные штаммы, и зонды ДНК с комплементарными последовательностями определенных областей вирусного генома. Они являются фундаментальным инструментом обнаружения вирусов. Эти зонды могут обнаруживать вирусы в нерепликативном состоянии. Культивирование или обнаружение антигенов с помощью иммунологических тестов невозможно. Последовательности вирусных генов могут реагировать с комплементарными зондами в фиксированной ткани с помощью гибридизации in situ. Тем не менее, возможно, что количество копий ДНК, присутствующих в образце, недостаточно для его обнаружения, и тогда необходимы методы геномной амплификации определенных фрагментов, среди которых ПЦР бесспорно выделяется.

Большинство клинических лабораторий используют методы ПЦР при диагностике вирусов на клинических образцах в их различных применениях и форматах. Это метод, которому удалось адаптироваться к рутине, упрощая и автоматизируя процесс, не теряя, скорее наоборот, чувствительности и специфичности. С помощью ПЦР в реальном времени, помимо получения результатов менее чем за час, можно точно определить количество копий гена-мишени вируса, присутствующих в образце, что определяет вирусную нагрузку, необходимую для мониторинга при лечении и развитии определенных инфекций, таких как ВИЧ, гепатиты В и С или цитомегаловирус. В качестве дополнительного метода он способен синтезировать идентичный геномный материал, в котором последовательность может быть изучена как уникальная комбинация и подвергнута сравнительному анализу с непревзойденным дискриминационным уровнем.

Косвенный диагноз (серология). Гуморальный иммунный ответ раскрывает историю инфекций пациента. Серологические исследования используются для выявления вирусов, которые трудно выделить в культуре и/или которые вызывают длительные инфекции. Это полезно для дифференциации серотипов, острой или хронической инфекции и определения того, является ли инфекция первичной или повторной. Обнаружение специфических антител класса IgM, которые обычно присутствуют в первые 2-3 недели первичной инфекции, обычно является диагностическим для первичной инфекции.

Сероконверсия предполагает появление антител IgG у ранее отрицательных пациентов или четырехкратное увеличение титра специфических антител в двух образцах, полученных с интервалом в 2-3 недели во время фазы выздоровления. Повторные инфекции или рецидивы вызывают реакцию отзыва, которая увеличивает уровень антител, следовательно, частые рецидивы у некоторых пациентов с герпетическими инфекциями предполагают, что уровень антител остается на высоком уровне.

Серологические методы, используемые при диагностике вирусных инфекций, очень разнообразны, включая методы агглютинации, непрямую иммунофлюоресценцию и иммуноферментные методы, поэтому в зависимости от цели определения будет использоваться наиболее подходящий метод с чувствительностью и специфичностью, адаптированными к цели, на которую направлена его реализация. В настоящее время хемилюминесцентные иммуноферментные методы обладают отличной чувствительностью и специфичностью, автоматизированы и позволяют получать результаты менее чем за час.

Однако серология имеет ограничения, которые необходимо признать. Наличие антител указывает на предыдущую инфекцию, но не на то, когда она произошла. Не следует исключать возможность ложноположительных и отрицательных результатов, и иногда антитела образуют иммунокомплексы с антигенами, что затрудняет их обнаружение. Перекрестные серологические реакции между различными вирусами могут привести к путанице. Тем не менее, при глубоком знании используемых методов и правильном выборе, наряду с необходимой клинической оценкой, серология является доступным и мощным диагностическим инструментом в определенных ситуациях.

Список литературы:

1. Lecuit M., Eloit M. The human virome: new tools and concepts. Trends Microbiol. 2013;21:510–515. 
2. Lund J.M., Hsing L., Pham T.T., Rudensky A.Y. Coordination of early protective immunity to viral infection by regulatory T cells. Science. 2008;320:1220–1224. 
3. Belkaid Y., Rouse B.T. Natural regulatory T cells in infectious disease. Nat Immunol. 2005;6:353–360. 
4. Virgin H.W. Pathogenesis of viral infection. In: Knipe D.M., Howley P.M., editors. Fields virology. Lippincott, Williams and Wilkins; Philadelphia: 2007. pp. p327–p388. 
5. Wald A., Zeh J., Selke S., Warren T., Ryncarz A.J., Ashley R. Reactivation of genital herpes simplex virus type 2 infection in asymptomatic seropositive persons. N Engl J Med. 2000;342:844–850. 
6. Li Q., Skinne P.J., Ha S.J., Duan L., Mattila T.L., Hage A. Visualizing antigenspecific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 2009;323:1726–1729. 
7. Virgin H.W., Wherry E.J., Ahmed R. Redefining chronic viral infection. Cell. 2009;138:30–50. 
8. Klenerman P., Hill A. T cells and viral persistence: lessons from diverse infections. Nat Immunol. 2005;6:873–879. 
9. Barber D.L., Wherry E.J., Masopust D., Zhu B., Allison J.P., Sharpe A.H. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 2006;439:682–687. 
10. CLSI . CLSI; CLSI document MM13-A, Wayne, PA (USA): 2005. Collection, transport, preparation and storage of specimens for molecular methods; approved guideline. 
11. Forman M.S., Valsamakis A. Specimen collection, transport and processing: Virology. In: Versalovic J., Carroll K.C., Funke G., Jorgensen J.H., Landry M.L., Warnock D.W., editors. Manual of clinical microbiology. 10a ed. ASM Press; Washingotn DC: 2011. pp. p1276–p1288. 
12. Landry L., Caliendo A.M., Ginnochio C.C., Tang Y.W., Valsamakis A. Algorithms for detection and identification of viruses. In: Versalovic J., Carroll K.C., Funke G., Jorgensen J.H., Landry M.L., Warnock D.W., editors. Manual of clinical microbiology. 10a ed. ASM Press; Washington DC: 2011. pp. p1297–p1301.